INMUNOHEMATOLOGIA ●: ● ● ● TECNICAS INMUNOLOGICAS

Se llaman técnicas inmunológicas por que utilizan una interacción antígeno-anticuerpo reversible en la que están involucrados enlaces no-covalentes.

Las técnicas inmunológicas mas utilizadas son: la reacción de fijación de complemento o Machado-Guerrreiro, la reacción indirecta de anticuerpos fluorescentes, hemaglutinación pasiva o indirecta, la reacción de anticuerpos líticos sanguíneos (ALBA), radioinmunoensayo (RIA) y la prueba de ELISA, que es el método de preferencia en la mayoría de laboratorios clínicos. Adicionalmente hay técnicas de muy alta especificidad y sensibilidad para detectar secuencias nucleotídicas de los ácidos desoxiribonucléicos del núcleo o del kinetoplasto, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual demanda recursos tecnológicos más sofisticados y de alto costo, no accesibles al poblador rural y para efectuar estudios de tipo epidemiológico.

TECNICA ELISA

Es utilizada para la detección de muy diversas moléculas biológicas, basándose en la especificidad del reconocimiento antígeno-anticuerpo y en la sensibilidad de las pruebas enzimáticas. La técnica de ELISA es un ensayo inmunoenzimático ampliamente empleado en el área médica para la cuantificación de moléculas especialmente de aquellas que experimentan cambios en diferentes estados como pueden ser infecciones por bacterias, virus, hongos o parásitos o fases activas de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se pueden medir por ELISA hormonas, autoanticuerpos, inmunoglobulinas contra antígenos de patógenos, toxinas, antígenos. Las técnicas de ELISA son también muy usadas en los ensayos de nuevos medicamentos para comprobar sus efectos cuantificando las moléculas de interés en cada caso. Existen numerosas variantes de este tipo de ensayo. Entre ellos se encuentran los métodos directo e indirecto. El método directo permite la detección del antígeno con un anticuerpo específico conjugado con una enzima como sistema de marcaje. En el método indirecto el antígeno reacciona con el anticuerpo específico. El complejo antígeno-anticuerpo es entonces detectado por un segundo anticuerpo que reconoce dominios constantes de anticuerpos. Este anticuerpo, que suele ser específico de especie, es el que está marcado enzimáticamente. Esto permite que un mismo anticuerpo marcado sea capaz de detectar diferentes antígenos. En ambos métodos, la reacción enzimática puede ser detectada espectrofotográficamente con un lector ELISA.

TECNICA DE PRECIPITACIÓN:

Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ac como el Ag se encuentren en un medio fluido en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac. Existen diferentes modalidades siendo las principales:
1. Técnica de precipitación propiamente dicha.
2. Técnica de difusión radial de Ouchterlony.
3. Técnica de inmunoelectroforesis.
4. Técnica de difusión radial simple de Mancini.
El complejo Ag-Ac precipita espontáneamente o por centrifugación cuando la proporción de Ags y Acs de la mezcla es equivalente. En la (Figura 1) se muestra un esquema de los tipos de complejos formados al mezclar, en tubos de ensayo, soluciones con diferentes cantidades de antígenos a los que se añaden igual cantidad de un antisuero. La precipitación es máxima allí donde la proporción entre ambos es óptima (parte central de la curva), pero va disminuyendo a medida que predomine el Ac o el Ag (izquierda y derecha de la curva respectivamente). Este tipo de reacción no es muy utilizado al requerirse grandes concentraciones de antígeno y de anticuerpo para poder medir el precipitado formado.

Técnicas de aglutinación

En estas técnicas se hacen vi sibles los complejos Ag-Ac por la aglutinación que producen los anticuerpos cuando el Ag forma parte o se ha unido artificialmente a la superficie de glóbulos rojos, plaquetas, leucocitos, partículas de látex, etc. Normalmente se utilizan glóbulos rojos ( hemaglutinación) o partículas de látex.

Hemaglutinación directa.

La presencia de antígenos en la superficie de los glóbulos rojos se puede detectar por la hemaglutinación producida cuando se añade un antisuero con anticuerpos frente a dichos antígenos. Esta técnica se emplea habitualmente para la identificación de los grupos sanguíneos y Rh, para lo cual a la sangre heparinizada se le añaden los antisueros correspondientes: anti- A, anti-B o anti-AB (todos ellos anti-Rh negativos). Habrá aglutinación cuand o los glóbulos rojos posean la especificidad del antisuero añadido (Tabla 2). De igual manera se procede con antisueros anti-Rh para la determinación de los distintos grupos Rh.

Hemaglutinación indirecta.

Se basa en el principio de la inhibición de la hemaglutinación. Para su realización se precisan glóbulos rojos a los cuales se les ha unido la misma sustancia que se desea detectar o cuantificar (Figura 5). Si estos glóbulos rojos son puestos en presencia de anticuerpos preparados frente a dicha sustancia se producirá su aglutinación. Por el contrario, cuando se añade un suero problema que contiene la sustancia a cuantificar entonces los anticuerpos se unirán a dicha sustancia y no a los glóbulos rojos. En este caso no se producirá la hemaglutinación. Por tanto, aglutinación (+) indica ausencia de la sustancia a estudiar, y aglutinación (-) indica presencia de la misma. La medida de gonadotropina coriónica (HCG) para el diagnóstico de embarazo puede realizarse por esta técnica.

OTRAS TÉCNICAS INMUNOLÓGICAS

PROTEÍNOGRAMA ELECTROFORÉTICO

El proteínograma electroforético es un técnica sencilla de laboratorio que permite separar en 5 fracciones o grupos a las proteínas presentes en un determinado fluido biológico (suero, orina, etc.). La técnica se basa en la separación electroforética de las distintas proteínas por medio de la aplicación de un campo eléctrico sobre un soporte de agarosa o acetato de celulosa. Una vez finalizada la corrida electroforética las bandas proteicas pueden ser visualizadas luego de la utilización de colorantes para proteínas. Posteriormente, las bandas que se observan a simple vista (Figura A) pueden ser cuantificadas por un densitómetro, el cual cuantifica la intensidad y anchura de cada banda (Figura B), pudiendo obtenerse los porcentajes de cada una de las 5 fracciones proteicas. Las distintas fracciones que podemos encontrar son: Albumina, alfa 1 globulinas (α1), alfa 2 globulinas (α2), beta globulinas (β) y gamma globulinas (γ). • ALBÚMINA: es una proteína que se sintetiza en el hígado y es la de mayor concentración en el suero. • α1: dentro de esta fracción se encuentran numerosas proteínas entre las cuales podemos mencionar a la alfa 1-antitripsina y la alfa 1-antiquimiotripsina

WESTERN BLOT

Es una técnica muy sensible que permite identificar Ags y Acs. Tal como puede observarse en la figura, la técnica de Western Blot se basa en la separación electroforética de proteínas en geles de poliacrilamida, la transferencia (blotting) de dichas proteínas a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa o nylon) y la posterior detección de una o más bandas identificadas por Acs específicos. La migración de las proteínas se realiza en presencia de detergentes (Dodecil Sulfato de Sodio, SDS) a fin de que su migración dependa fundamentalmente de peso molecular (PM) de los péptidos. Así descripta, la técnica permite investigar la presencia de un antígeno dado en una mezcla de proteínas presentes en una determinada muestra y para ello se debe disponer del Ac específico para marcar la membrana. Sin embargo, la técnica de Western Blot es también muy útil para la detección de Acs específicos en sueros. Si se desea detectar Acs específicos, debe contarse con el Ag de interés separado por electroforesis y transferido a una membrana, la cual se incubará con el suero a analizar. Posteriormente esa membrana deberá incubarse con el segundo anticuerpo marcado con la enzima para poder detectar las bandas específicas. La técnica de Western Blot para determinar la especificidad de los Acs contra Ag del virus de HIV es la prueba confirmatoria de elección para los casos en que los sueros de los pacientes dieron un ELISA positivo

TÉCNICAS SEROLÓGICAS: Microlinfocitotoxicidad en placas de Terasaki Fundamento: Este método se basa en el empleo de anticuerpos específicos contra diferentes alelos del HLA (moléculas de clase I y de clase II). Cuando estos anticuerpos reconocen al antígeno contra el cual son específicos, y en presencia de complemento, se produce la lisis celular. El ensayo se realiza en placas plásticas de 60 fosas denominadas placas de Terasaki y la muerte celular se cuantifica mediante una tinción diferencial de células viables y muertas. Etapas:

1. Extracción de sangre del paciente

2. Aislamiento de células mononucleares (centrifugación en gradiente de Ficoll®)

3. Siembra de células en fosas de placas de Terasaki previamente sensibilizadas con sueros policlonales contra diferentes alelos del HLA.

4. Incubación (unión de los Ac a las moléculas de clase I o de clase II del HLA)

5. Agregado de fuente de complemento (suero de conejo)

6. Incubación y lisis de células que unieron Ac en la etapa anterior

7. Agregado de un colorante de contraste para diferenciación de células vivas y muertas (diacetato de fluoresceína)

8. Observación microscópica y clasificación.

TECNICAS MOLECULARES

Fundamento:

En este método se realiza una reacción de cadena de polimerasa (PCR) utilizando como molde el ADN extraído de células de sangre periférica del paciente. Como oligonucleótidos cebadores ("primers") se emplean combinaciones de oligonucleótidos específicos para diferentes alelos del HLA. De esta manera se logra la amplificación de fragmentos de ADN de diferente longitud. El patrón de fragmentos de ADN obtenido, que se analiza en una electroforesis en gel de agarosa, permite asignar alelos a la muestra analizada. Esto implica que para cada muestra se deben realizar un número considerable de reacciones de PCR (tantas como pares de "primers" se estén empleando, lo que a su vez se reflejará en el grado de resolución alcanzado). Etapas: 1. Extracción de sangre del paciente 2. Aislamiento del ADN 3. Reacción de cadena de polimerasa (PCR) con diferentes combinaciones de "primers" 4. Electroforesis en geles de agarosa conteniendo bromuro de etidio 5. Observación del patrón de bandas de ADN amplificadas en la PCR bajo luz UV 6. Integración de los resultados obtenidos 7. Asignación de alelos a la muestra analizada

han sustituido en muchos casos. Sin embargo, cabe mencionar, que las reacciones de aglutinación presentan una menor sensibilidad que las reacciones de interacción primaria tales como ELISA e Inmunofluorescencia indirecta (ver mas adelante). Esto hace que en determinados casos se prefiera el empleo de una de estas 2 técnicas para la detección de Acs contra un determinado agente patógeno. Las ventajas enumeradas hacen de las reacciones de aglutinación una valiosa herramienta para diversos estudios serológicos (búsqueda de Acs específicos contra agentes patógenos) y para la detección de antígenos en fluidos biológicos. Tipos de reacciones de aglutinación según las características de las partículas aglutinantes: De acuerdo a las características de las partículas aglutinantes, las reacciones de aglutinación pueden clasificarse en:

- reacciones de aglutinación activa; o

- reacciones de aglutinación pasiva.

Las reacciones de aglutinación activa se basan en el empleo de la partícula aglutinante como antígeno. Como ejemplos podemos mencionar: